初代火影千手柱间的死因并没有一个明确的官方答案，但根据不同的资料和推测，可以得出以下几种可能：
操劳过度，心力交瘁而死
初代火影在平定乱世、创建木叶村之后，由于长时间处于高压和紧张的状态，加上频繁使用木遁等强大的忍术，导致身体和精神都受到了极大的损耗，最终心力交瘁而死。
战死于终结谷之战
在终结谷之战中，初代火影与宇智波斑展开了激烈的战斗，最终虽然击败了斑，但自身也受到了致命的伤害。有推测认为他是在这场战斗后不久便死亡。
被敌人诅咒或暗杀
有推测认为初代火影可能死于敌人的诅咒或暗杀。例如，晓组织中的飞段可能通过某种手段得到了他的血液并进行诅咒，或者黑绝等幕后人物可能对他进行了暗杀。
保护村子而牺牲
纲手曾提到初代火影是为了保护村子而去世的，这可能意味着他在木叶村建立后，为了保护村子和人民，最终献出了自己的生命。
综合以上信息，最有可能的死因是初代火影在经历了长期战乱和创建木叶村的重任后，因操劳过度和心力交瘁而死。尽管存在其他推测，但没有确凿的证据支持这些猜测，因此只能认为他是因为过度劳累和保护村子而牺牲。