从酵母中提取较纯的RNA可以通过以下步骤进行:
材料准备
新鲜或干燥的酵母粉。
所需的试剂,如SDS-缓冲液、饱和酚、氯仿、异戊醇、95%乙醇等。
仪器设备,包括离心机、恒温水浴、干燥箱、天平、分光光度计等。
提取RNA
稀碱法:
将酵母粉与0.2% NaOH溶液混合,沸水浴加热30分钟,期间不断搅拌。
加入乙酸使溶液呈酸性,离心去除菌体和其他杂质。
上清液中加入2倍体积的95%乙醇,静置使RNA沉淀。
用95%乙醇洗涤RNA沉淀,最后用无水乙醇脱水。
浓盐法:
将酵母粉与含有6 mol/L HCl的溶液混合,加热至60-70摄氏度保持一段时间。
冷却后离心去除菌体,上清液调至等电点(pH 2.0-2.5),使RNA沉淀。
用95%乙醇洗涤RNA沉淀,最后用无水乙醇脱水。
进一步纯化
酚氯仿法:
将提取的RNA溶液与含有SDS的缓冲液混合,加入等体积的水饱和酚,剧烈振荡。
离心后,水相含有RNA,下层为酚相和变性蛋白。
吸出水相,加入乙醇沉淀RNA。
可用氯仿-异戊醇进一步处理以提高纯度。
RNA的定量和纯度检测
使用分光光度计测定RNA在260 nm处的吸光度,计算RNA的浓度。
可通过电泳检测RNA的纯度,观察是否有清晰的28S和18S条带。
建议
在实验过程中,要严格控制pH值和温度,确保RNA的稳定性和提取效率。
彻底去除细胞壁和蛋白质是提取纯RNA的关键步骤。
提取过程中要注意安全,避免接触有机溶剂。
根据具体实验需求选择合适的提取方法,以提高RNA的纯度和产量。