反相色谱（RPC）是一种 利用非极性的反相介质为固定相，极性有机溶剂的水溶液为流动相的色谱法。它根据溶质的极性（疏水性）差别进行溶质分离与纯化。在RPC中，溶质通过疏水性相互作用分配于固定相表面，而固定相表面完全被非极性基团所覆盖，表现出强烈的疏水性。因此，需要用极性有机溶剂（如甲醇、乙腈等）或其水溶液进行溶质的洗脱分离。溶质在反相介质上的分配系数取决于其疏水性，疏水性越大，分配系数越大。通过调节流动相的组成，可以调整溶质的分配系数，从而实现对不同溶质的有效分离。
RPC主要应用于相对分子质量低于5000，特别是1000以下的非极性小分子物质的分析和纯化，同时也可用于蛋白质等生物大分子的分析和纯化。然而，由于反相介质表面为强烈疏水性，并且流动相为低极性的有机溶剂，生物活性大分子在RPC分离过程中容易变性失活，所以在以回收生物活性蛋白质为目的时，应注意选用适宜的反相介质。
常见的反相介质包括以硅胶为载体，通过表面键合非极性分子层制备的填料，其中键合有C18、C8、C2的球形多孔填料最为常见，用途最广。在生物大分子分离中，多采用离子强度较低的酸性水溶液，并添加一定量乙腈、异丙醇或甲醇等与水互溶的有机溶剂作为流动相。