《美国队长3》中的主要反派角色是 二代泽莫男爵（Helmut Zemo），由丹尼尔·布鲁赫（Daniel Brühl）饰演。泽莫男爵为了给被冬兵杀害的家人复仇，制定了一系列计划，包括洗脑冬兵和获取记载九头蛇秘密的日记。他的行为最终导致了复仇者联盟的分裂。
此外，电影中还出现了其他一些角色，虽然他们并非主要反派，但也与剧情有重要关联，例如 交叉骨（Crossbones），由弗兰克·格里洛（Frank Grillo）饰演，他是红骷髅的忠实追随者，并在《美国队长2：寒冬战士》中出现过。
综合来看，二代泽莫男爵是《美国队长3》中的核心反派人物。